สต็อกกลีเซอรอลเป็นสารแขวนลอยชนิดหนึ่งที่ใช้ในห้องปฏิบัติการเพื่อเก็บการเพาะเชื้อแบคทีเรียเป็นระยะเวลานาน เมื่อเพิ่มวัฒนธรรมแบคทีเรียเหลวลงในสารละลายกลีเซอรอล 50% กลีเซอรอลจะซึมซาบเข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย ทำให้โครงสร้างมีเสถียรภาพและจัดเก็บได้อย่างปลอดภัย หลังจากผสมตัวอย่างของคุณแล้ว ให้แช่แข็งตัวอย่างที่ −80 °C (−112 °F) เพื่อให้แน่ใจว่าตัวอย่างจะยังคงใช้งานได้นานที่สุด
ขั้นตอน
ส่วนที่ 1 จาก 3: การผสมสารละลายกลีเซอรอล
ขั้นตอนที่ 1 เตรียมการเพาะเชื้อของเหลวของแบคทีเรียที่คุณต้องการเก็บ
เพื่อให้สต็อกกลีเซอรอลมีประสิทธิภาพ จะต้องรวมกับการเพาะเชื้อแบคทีเรียเหลว การผลิตอาหารเหลวจะทำให้คุณต้องฟักตัวอย่างแบคทีเรียในชั่วข้ามคืนในขวดรูปชมพู่ที่เติมน้ำซุปไลโซจีนีและความเข้มข้นของยาปฏิชีวนะที่ถูกต้อง
- เมื่อคุณเตรียมการเพาะเลี้ยงของเหลวแล้ว คุณสามารถเก็บแบคทีเรียในการจัดเก็บหรือแยก DNA พลาสมิดออก
- Lysogeny broth (เรียกอีกอย่างว่า "LB broth" และ "LB liquid") เป็นของเหลวที่อุดมด้วยสารอาหารชนิดหนึ่งที่ใช้ในการแพร่เชื้อแบคทีเรียอย่างรวดเร็ว สามารถซื้อได้จากร้านค้าปลีกที่ขายอุปกรณ์และวัสดุในห้องปฏิบัติการ
- การเพาะเลี้ยงเชื้อแบคทีเรียเป็นกระบวนการทางเทคนิคขั้นสูงที่เกี่ยวข้องกับตัวแปรต่างๆ มากมาย ด้วยเหตุนี้ จึงควรดำเนินการโดยช่างเทคนิคที่ผ่านการฝึกอบรมในห้องปฏิบัติการที่มีการควบคุม
ขั้นตอนที่ 2 เจือจางกลีเซอรอลบริสุทธิ์ในน้ำกลั่นเพื่อสร้างสารละลายกลีเซอรอล 50%
ใช้ปิเปตปลอดเชื้อเพื่อตวงของเหลวทั้งสอง 10 มล. และผสมให้เข้ากันในขวดเดียว คนหรือเขย่าขวดให้ละเอียดจนของเหลวผสมเข้ากัน
- การเจือจางกลีเซอรอลเป็นสิ่งจำเป็นเพื่อป้องกันไม่ให้เซลล์แบคทีเรียเสียหาย
- นักวิทยาศาสตร์บางคนชอบที่จะใช้สารละลายกลีเซอรอลให้ต่ำเพียง 15-40% เพื่อหลีกเลี่ยงไม่ให้เกิดการเพาะเชื้อแบคทีเรีย อย่างไรก็ตาม ส่วนผสม 50% จะให้อายุการเก็บรักษาที่ยาวนานที่สุด
ขั้นตอนที่ 3 ถ่ายโอน 50 ไมโครลิตรของสารละลายกลีเซอรอล 50% ไปยังหลอดไมโครฟิวจ์
ย้ายกลีเซอรอลที่เจือจางไปยังขวดใหม่อย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงการหก คุณจะใช้ภาชนะเดียวกันนี้เพื่อใส่สารละลายกลีเซอรอลกับแบคทีเรียที่เป็นของเหลว และวางตัวอย่างลงในห้องเย็น
ถ้าเป็นไปได้ ให้ใช้ท่อที่มีฝาเกลียว แทนที่จะใช้ท่อแบบมีปุ่มปิด เป็นที่ทราบกันว่าหลอดสแน็ปด้านบนเปิดโดยไม่ได้ตั้งใจระหว่างการผสมและการเก็บรักษาเป็นเวลานาน
ส่วนที่ 2 จาก 3: การเพิ่มวัฒนธรรมแบคทีเรีย
ขั้นตอนที่ 1 เพิ่ม 50 ไมโครลิตรของวัฒนธรรมแบคทีเรียเหลวของคุณลงในสารละลาย
ใช้ปิเปตสดในการวัดปริมาณที่เท่ากันของการเพาะเลี้ยงของเหลว และเทลงในสารละลายกลีเซอรอลในหลอดโดยตรง สัดส่วนสุดท้ายของสต็อกกลีเซอรอลของคุณควรเป็นแบคทีเรีย 50% และกลีเซอรอลเจือจาง 50%
- การใช้กลีเซอรอลและการเพาะเลี้ยงของเหลวในปริมาณที่ไม่สมส่วนอาจส่งผลต่อความแข็งแกร่งของแบคทีเรีย และลดระยะเวลาที่สามารถอยู่รอดได้ในห้องเย็น
- หากคุณกำลังใช้สารละลายกลีเซอรอลที่มีความเข้มข้นต่ำกว่า คุณจะต้องปรับปริมาณการเพาะเชื้อแบคทีเรียตามลำดับ ศึกษาเอกสารที่เกี่ยวข้องกับความเครียดที่คุณจัดเก็บสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม
ขั้นตอนที่ 2. วางฝาบนหลอด
ขันฝาให้เข้าที่ หรือกดลงจนได้ยินเสียงคลิกเบาๆ หากคุณใช้ท่อแบบ snap-top ตรวจสอบให้แน่ใจว่าฝาปิดแน่นดีแล้วก่อนดำเนินการต่อ
ขั้นตอนที่ 3 เขย่าหลอดเบา ๆ เพื่อผสมแบคทีเรียและกลีเซอรอล
ปัดหลอดไปมาสองสามครั้งจนของเหลวทั้งสองกระจายตัวเท่ากัน ณ จุดนี้ เซลล์แบคทีเรียจะค่อยๆ เริ่มดูดซับสารละลายกลีเซอรอล ซึ่งจะทำให้เสถียรภาพและปกป้องเยื่อหุ้มเซลล์จากการเสื่อมสภาพและความเสียหายที่เกี่ยวข้องกับอุณหภูมิ
กดนิ้วโป้งของคุณกับฝาของหลอดไมโครฟิวจ์อย่างแน่นหนาขณะเขย่าเพื่อให้แน่ใจว่าจะไม่หลุดออกมา
ส่วนที่ 3 ของ 3: การจัดเก็บและฟื้นฟูวัฒนธรรมแบคทีเรีย
ขั้นตอนที่ 1. ติดฉลากตัวอย่างแบคทีเรีย
เขียนชื่อของวัฒนธรรมบนฉลากหลอดทดลองขนาดเล็กหรือแถบเทปกาว แล้วติดเข้ากับหลอดไมโครฟิวจ์ในที่ซึ่งมองเห็นได้ชัดเจน คุณยังสามารถจดข้อมูลการจำแนกประเภทของแบคทีเรียลงบนฝาได้โดยตรงโดยใช้ปากกามาร์คเกอร์แบบสักหลาด
- อย่าลืมบันทึกข้อมูลอื่นๆ ที่อาจเป็นประโยชน์ระหว่างการวิเคราะห์ เช่น สายพันธุ์ที่แน่นอนของตัวอย่างหรือที่มาของตัวอย่าง
- การติดฉลากคอนเทนเนอร์ตัวอย่างของคุณเป็นขั้นตอนที่ขาดไม่ได้ในกระบวนการรวบรวม เนื่องจากช่วยให้คุณสามารถติดตามเนื้อหาในคอนเทนเนอร์ขณะที่สับเปลี่ยนเข้าและออกจากที่จัดเก็บ
ขั้นตอนที่ 2 แช่แข็งตัวอย่างที่อุณหภูมิ −80 °C (−112 °F)
วางตัวอย่างที่ติดฉลากไว้ในตู้แช่แข็งในห้องปฏิบัติการที่เย็นมาก โดยตั้งอุณหภูมิคงที่ที่ −80 °C (−112 °F) เมื่ออยู่ภายใต้สภาวะเหล่านี้ การเพาะเลี้ยงแบคทีเรียจะคงอยู่ได้นานหลายปี
สิ่งสำคัญคืออุณหภูมิของช่องแช่แข็งจะต้องคงที่ที่ −80 °C (−112 °F) หากถูกทำให้อุ่นขึ้น แบคทีเรียที่เก็บรักษาไว้อาจตายได้
ขั้นตอนที่ 3 ขูดแบคทีเรียแช่แข็งจำนวนเล็กน้อยเพื่อเตรียมสำหรับการวิเคราะห์
เมื่อถึงเวลาชุบชีวิตตัวอย่างของคุณ ให้นำหลอดไมโครฟิวจ์ออกจากช่องแช่แข็งแล้วเปิดฝา ใช้ห่วงเพาะเชื้อ ไม้จิ้มฟัน หรือปลายปิเปตเพื่อเก็บวัสดุแช่แข็งจำนวนเล็กน้อยจากด้านบนของตัวอย่างและนำแบคทีเรียไปวางบนจานวุ้น LB เพื่อทำการตรวจสอบหรือทดสอบ
- ระวังอย่าให้แบคทีเรียขูดละลาย การเก็บหลอดสต็อกไว้บนน้ำแข็งแห้งอาจช่วยได้จนกว่าคุณจะทำการทดสอบเสร็จ
- ดึงตัวอย่างของคุณออกจากช่องแช่แข็งเมื่อจำเป็นเท่านั้น การละลายและการแช่แข็งซ้ำๆ จะทำให้อายุการใช้งานลดลงอย่างมาก